Nachweis von aktiven Infektionen

Nachweis von aktiven Infektionen © Pexels Martin Lopez

Eine Infektion ist aktiv, so lange noch vermehrungsfähiges Virus im Körper vorhanden ist. Verfahren zum Nachweis einer aktiven SARS-CoV-2-Infektion zielen daher auf den direkten Nachweis des Virus im Probenmaterial ab (siehe auch: https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html). Die Aussagekraft solcher Tests hängt von ihrer Empfindlichkeit (Sensitivität) ab, aber auch davon, inwieweit die Präsenz des Virus im Körper sich im verfügbaren Untersuchungsmaterial widerspiegelt. Der Art des gewonnenen Untersuchungsmaterials, der korrekten Entnahme und dem sachgerechten Transport der Probe kommt daher eine wichtige Bedeutung zu.

Im Falle von SARS-CoV-2 kann sich die Fragestellung hinter einer Laboruntersuchung auch darauf beziehen, ob die betreffende infizierte Person noch ansteckend ist oder nicht. Ist die eingesetzte Untersuchungsmethode sehr empfindlich, geht man bei einem negativen Virusnachweis-Test in der untersuchten Probe davon aus, dass keine Ansteckungsgefahr mehr besteht. Nimmt man allerdings an, dass nur Personen ansteckend sind, die eine höhere Viruslast von SARS-CoV-2 ausscheiden, wofür neuere Daten einige Anhaltspunkte liefern, kann man bei einer hochempfindlichen Methode (z. B. PCR) einen quantitativen Grenzwert festlegen, ab dem man von einer bestehenden Infektiosität ausgeht, oder aber eine weniger empfindliche Methode einsetzen (z. B. einen Antigentest), die nur höhere Virusmengen erfasst.

PCR-Tests

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Das Standardverfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2 ist der Nachweis von Virus-RNA mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR). Dabei werden bestimmte Zielgen-Abschnitte, die für das Virus spezifisch sind, detektiert und so stark vervielfältigt, dass sie mit einer Sekundärreaktion durch Bindung spezifischer Sonden an die vervielfältigten Zielsequenzen nachgewiesen werden können. Man verwendet dazu in vitro synthetisierte, kurze Startermoleküle (Primer), die sich ganz spezifisch an die komplementären Zielsequenzen auf dem Virusgenom, und zwar am Anfang und am Ende der nachzuweisenden Zielsequenz, anlagern. Ausgehend von den Startermolekülen wird dann die gesamte Nukleinsäuresequenz zwischen ihnen mit Hilfe der Polymerase vervielfältigt. Da es sich beim SARS-CoV-2 um ein RNA-Virus handelt, müssen die RNA-Zielsequenzen zunächst in eine komplementäre DNA umgeschrieben werden, was durch ein Enzym namens Reverse Transkriptase bewerkstelligt wird. Die PCR wird überdies durch Mitführen eines internen Referenzstandards quantitativ durchgeführt und der Nachweis des Amplifikationsprodukts erfolgt während der laufenden Vervielfältigung des Zielgens in Echtzeit, so dass man von einer RT-qPCR (quantitative Reverse-Transkriptase-Echtzeit-PCR) spricht. Eine RT-qPCR-Analyse dauert im Labor etwa 3-5 Stunden. Basierend auf vergleichenden Analysen der Nukleinsäuresequenzen der schon bekannten Beta-Coronaviren sowie des neuen SARS-CoV-2 konnten schon Anfang Januar 2020 erste PCR-Nachweisverfahren für das neuartige Coronavirus etabliert werden. Die PCR-Tests zeichnen sich durch eine hohe Empfindlichkeit (Sensitivität) und gleichzeitig eine hohe Spezifität, d.h. nur wenige falsch-positive Testergebnisse, aus. Sie haben daher den Stellenwert von Referenztests bzw. Goldstandards unter den Verfahren zum direkten Virusnachweis.

Die mittlerweile auch CE-zertifizierten käuflichen PCR-Testkits enthalten die benötigten spezifischen Primer und Sonden. Die PCR-Diagnostik verläuft gemäß den gängigen Empfehlungen der WHO in einem Stufenschema, bei dem im optimalen Fall mehrere Zielsequenzen amplifiziert werden. Dies kann im gleichen Testansatz erfolgen. Die Targets umfassen Regionen des E, RdRP, N und S-Gens. Eine auf das E-Gen (Envelope-Gen, das für das Hüllprotein kodiert) gerichtete PCR ist sehr sensitiv, erfasst aber auch andere SARS-CoV-verwandte Betacoronaviren des Subgenus Sarbecovirus und ist daher nicht vollständig spezifisch für SARS-CoV-2. Ein positiver PCR-Nachweis des E-Gens bedarf daher zur Sicherheit noch der Bestätigung mittels einer zweiten PCR-Reaktion, bei der gewöhnlich das RdRP Gen (Abschnitt des Gens für die RNA-abhängige RNA-Polymerase) Zielgen ist. Diese Zielsequenz ist in der Entwicklungsgeschichte der Beta-Coronaviren wenig konserviert und daher speziesspezifisch. Die darauf basierende PCR ist folglich spezifisch für SARS-CoV-2. Zu dem beschriebenen zweistufigen Ansatz wurden mittlerweile alternative PCR-Nachweise mit anderen Zielgenen entwickelt, beispielsweise die ebenfalls für SARS-CoV-2 spezifischen N- und S-Gene, das Orf1ab-Gen und das M-Gen.

Mittels PCR kann mit hoher Sicherheit geklärt werden, ob eine Infektion mit SARS-CoV-2 vorliegt. Dies umfasst auch asymptomatische oder pauci-symptomatische Personen, die sich noch innerhalb der Inkubationszeit befinden (im Mittel 5-6 Tage). Das Virus kann etwa 3 Tage vor Auftreten der ersten Symptomatik (präsymptomatisch) detektiert werden, wobei die höchste Konzentration von SARS-CoV-2 im oberen Respirationstrakt einige Stunden vor Auftreten der ersten Symptome und um den Zeitpunkt der ersten Symptome am höchsten ist. Durch einen positiven Test ist die Infektion bestätigt. Liegt eine entsprechende Symptomatik vor, so kann die Diagnose einer COVID-19-Erkrankung gestellt werden. Ist die PCR negativ, so schließt dies eine SARS-CoV-2-Infektion nicht absolut aus. Vielmehr könnte das Probenmaterial zum falschen Zeitpunkt entnommen worden oder die Gewinnung des Probenmaterials unzulänglich gewesen sein. Gegebenenfalls muss daher die Untersuchung wiederholt werden, insbesondere wenn die betreffende Person COVID-19-verdächtige Symptome zeigt. Die PCR wird überdies bei COVID-19-Patienten zur Verlaufskontrolle eingesetzt, insbesondere auch um festzustellen, ab wann kein Virus mehr ausgeschieden wird und somit keine Infektiosität mehr besteht.

Neben den RT-qPCR-Verfahren, die einen hohen Anspruch an die Ausbildung des Laborpersonals stellen, sind inzwischen kompakte und vor allem einfach anzuwendende Testsysteme für die Nukleinsäureamplifikation erhältlich, zum Beispiel Kartuschen-Systeme. Diese Tests können sowohl im Labor als auch als Point-of-Care-Tests (POCT), also direkt am Ort der medizinischen Patientenversorgung, eingesetzt werden. Sie verwenden in der Regel von der WHO veröffentlichte Zielsequenzen auf dem N-, E-, S- bzw. RdRP-Gen. Ähnlich wie bei der RT-PCR wird zum Beispiel in einem Schritt die E-(Envelope)-Gensequenz, in einem weiteren als Bestätigungs-PCR die SARS-CoV-2-spezifische N2-(Nukleokapsid)-Gensequenz nachgewiesen. Die Kartuschen-basierten Tests haben eine kurze Laufzeit von unter einer Stunde. Außerdem entfällt (in der Regel) die Nutzung eines separaten Transportmediums. Die Patientenprobe kann direkt in die geschlossene Testkartusche eingebracht werden, die bereits alle Reagenzien für die Nukleinsäureaufreinigung und die anschließende PCR-Reaktion als geschlossenes System enthält. Kartuschentest-Systeme mehrerer Hersteller besitzen bereits eine IVD-CE-Zertifizierung oder stehen kurz davor diese zu erhalten. Im Vergleich zu den offenen RT-qPCR-Systemen sind die Kartuschentests jedoch sehr teuer, der Probendurchsatz in den Geräteplattformen, die die Kartuschen verarbeiten, ist sehr begrenzt. Die Empfindlichkeit erreicht diejenige der konventionellen RT-qPCR-Verfahren nicht ganz. Die Kartuschentests sind daher nicht für den Massendurchsatz von Proben, sondern nur für individuelle Testanforderungen geeignet.

Als Probenmaterial für den direkten Erregernachweis mittels PCR eignet sich Material aus den oberen Atemwegen, vorzugsweise ein Nasopharynx-Abstrich, bei dem ein dünner Tupfer durch die Nase bis an die Rachenhinterwand eingeführt wird. Ein Abstrich direkt von der Rachenhinterwand durch die Mundhöhle wird von den Patienten meist besser toleriert, führt aber zu etwas geringerer Empfindlichkeit der Untersuchung. Wichtig ist, dass durch entsprechend kräftige Bewegungen des Tupfers aus der oberen Schleimhautschicht genügend Material mit Zellen entnommen wird. Gegebenenfalls können auch alternativ zum Nasopharynxabstrich ein nacheinander mit dem gleichen Tupfer entnommener Rachen- und Nasenabstrich kombiniert werden. Je nach klinischer Situation und Fragestellung kommt insbesondere im späteren Verlauf der Erkrankung auch Untersuchungsmaterial aus den unteren Atemwegen (Sputum, bronchoalveoläre Lavage, Trachealsekret) in Frage bzw. ist dann zu bevorzugen, um in allen Phasen des Erkrankungsgeschehens eine höchstmögliche Chance zum Nachweis des Erregers zu gewährleisten.

Point-of-Care-Tests

Als Point-of-Care-Tests werden solche Tests bezeichnet, die auch Patienten-nah zur Anwendung kommen können, da sie nicht unbedingt der Handhabung durch Laborfachpersonal bedürfen und daher auch nicht notwendigerweise in einem Fachlabor durchgeführt werden müssen.

PCR im geschlossenen Kartuschen-System
Die im Kartuschen-Format angebotenen PCR-Systeme (siehe oben) können bei entsprechender Schulung des Personals, insbesondere im Hinblick auf die Vermeidung von Kontaminationen, auch als Point-of-Care-Tests eingesetzt werden. Die geschlossenen Systeme verlangen nur das kontaminationsfreie Einbringen der Probe und das Verbringen der beladenen Kartusche in die Geräteplattform, die vergleichsweise einfach zu bedienen ist.

Neben den Kartuschen-Systemen gibt es auch zunehmend POCT-Plattformen, die eine real-time PCR (RT-PCR) zur Verarbeitung und Analyse Hersteller-spezifischer molekularer Einzeltests verwenden. Diese speziell für die jeweilige Plattform konfigurierten Tests werden zum qualitativen Nachweis von SARS-CoV-2-Virus-RNA in direktem Nasopharyngeal-(NP) oder Oropharyngeal-(OP) Abstrich von Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer Atemwegsinfektion verwendet, bei denen der Verdacht auf COVID-19 besteht. In der Regel sind diese Tests für den Gebrauch „direkt am Patienten“ (das bedeutet dort, wo auch die Probennahme erfolgt!) konzipiert und zugelassen. Solche Tests ermöglichen den Nachweis von SARS-CoV-2 in ca. 20 Minuten. Die „Hands-on“ Zeit beträgt etwa 1-2 Minuten. Der Schulungsbedarf wird mit „minimal“ bezeichnet; dennoch sind sowohl Kenntnisse in der Probennahme (siehe oben) als auch in der Durchführung der Tests auf den jeweiligen Plattformen notwendig, um die Fehlerquote niedrig zu halten.

Antigentests

Im Gegensatz zur PCR zielen diese Tests nicht auf das Genom des Erregers, sondern auf seine Proteinbestandteile. Meist werden dafür spezifische Antikörper eingesetzt, die an einen Träger gebunden sind. Diese binden das Ziel-Antigen (Protein) des Erregers spezifisch, die Bindung wird anschließend mittels einer Detektionsreaktion sichtbar gemacht, so dass nach wenigen Minuten eine Beurteilung mit dem bloßen Auge anhand eines Farbumschlags oder mit einem Ablesegerät erfolgen kann. Da das Ziel-Protein dabei nicht vervielfältigt wird, haben die Tests eine deutlich geringere Empfindlichkeit als die Genom-basierten Nachweise.

Am häufigsten werden Membran-gebundene Testformate verwendet, z. B. Streifentests (Lateral-Flow-Tests) oder Kassettentests, in die das Untersuchungsmaterial direkt eingebracht werden kann. Im akuten Stadium von COVID-19, in dem SARS-CoV-2 in großer Menge im Respirationstrakt vorhanden ist, bietet der Antigennachweis eine weitere Möglichkeit den Erreger direkt aus dem Untersuchungsmaterial der oberen Atemwege nachzuweisen. Meist werden Tests verwendet, bei denen monoklonale Antikörper gegen Oberflächenproteine des Viruspartikels, wie das Nukleokapsidprotein und/oder die S1-Domäne des Spikeproteins, als „Antigen-Fänger“ an die Membran gebunden sind. Die Sensitivitätswerte werden in der Literatur recht unterschiedlich angegeben. Sie liegen jedoch deutlich unter den Werten, die mittels PCR zu erreichen sind. Die Herstellerangaben (Sensitivitätswerte bis 96%) beziehen sich in der Regel auf Proben mit höheren Virusmengen, wie sie bei Patienten in den ersten Krankheitstagen bzw. kurz vor (!) Auftreten der ersten Symptome vorkommen. Insbesondere bei höhere Virusmengen zeigen die Antigentests akzeptable Sensitivitätswerte. Die Tests werden daher vor allem für die Anwendung an Patienten in der akuten Krankheitsphase beworben bzw. sind lediglich für die Testung von symptomatischen Patienten zugelassen. Bei den Antigentests handelt es sich meist um Schnelltests, die als Detektionsreaktionen enzymvermittelte Farbumschläge oder Chemilumineszenz nutzen. Sie liefern etwa 15 Minuten nach Zugabe von Probenmaterial und Puffer ein (qualitatives) Ergebnis. Im Kassetten- oder Streifentest-Format eignen sie sich als Point-of-Care-Tests für die im Kapitel „Nachweisstrategien“ beschriebenen Anwendungszwecke.

Sie werden zunehmend auch als Plattform-basierte Antigentests angeboten, die einen deutlich größeren Probendurchlauf ermöglichen. Diese auf Massentestung ausgelegte Variante bleibt dann jedoch Laboratorien vorbehalten und dient nicht als Point-of-Care-Test.