Nach­weis von Anti­körpern

P. Scheid, L. Zöller

Nachweis von Antikörpern © COLOURBOX

Antikörper-Tests weisen nicht den Erreger selbst nach, sondern die Immunreaktion des Wirts, die u.a. darin besteht, Antikörper gegen den Erreger bzw. seine immunogenen Eiweißbestandteile (Protein-Antigene) zu bilden. Beim SARS-CoV-2 sind das in erster Linie die S- und N-Proteine. Antikörper, die verhindern können, dass das Virus an die menschliche Zelle bindet und in diese eindringt, bezeichnet man als neutralisierende Antikörper. Diese verleihen dem infizierten Individuum Schutz gegen eine erneute Infektion durch das gleiche Virus. Der Nachweis neutralisierender Antikörper spricht daher für eine bestehende Immunität.

Bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 treten in der Regel zeitlich differenziert Antikörper der verschiedenen Immunglobulinklassen (IgG, IgM, IgA) auf. IgG-Antikörper werden im Blut im Laufe der zweiten Krankheitswoche nachweisbar, Antikörper vom Typ IgM und IgA sind bereits 3-6 Tage nach Symptombeginn nachweisbar (https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x). IgM-Antikörper treten im Blut zuerst auf und lassen sich nach überstandener Infektion nur zeitlich begrenzt nachweisen. Ihr Nachweis spricht daher für eine frische Infektion. IgG-Antikörper persistieren nach einer Infektion hingegen langfristig. Ihre Bildung kann durch das immunologische Gedächtnis nach einer erneuten Exposition kurzfristig stimuliert werden. Neutralisierende IgG-Antikörper können daher einen langfristigen Immunschutz verleihen. IgA-Antikörper sind Schleimhaut-assoziierte Antikörper, die in der akuten Phase der Infektion auch im Blut nachgewiesen werden können. Die Ig-Klassen-differenzierende quantitative Bestimmung der SARS-CoV-2-spezifischen Antikörper erlaubt entscheidende Rückschlüsse auf Infektionsbeginn und Infektionsstatus. Insbesondere der Nachweis von spezifischen IgG-Antikörpern gilt als Nachweis einer durchgemachten Infektion, und kann daher in epidemiologischen Studien zur Untersuchung der Durchseuchung von Populationen verwendet werden.

Was kann mit Antikörpertests erreicht werden?

L. Zöller

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Der diagnostische Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion beruht in erster Linie auf dem Virusnachweis mittels PCR. Antikörper-Nachweise können als zusätzliches diagnostisches Hilfsmittel eingesetzt werden, wenn der Verdacht auf eine SARS-CoV-2-Infektion erst spät im Krankheitsverlauf oder in der Rekonvaleszenzphase gestellt wird, wenn die PCR bereits wieder negativ ist. So kann die Diagnose auch noch retrospektiv gestellt werden. Andererseits sind im frühen Krankheitsverlauf die Antikörpertests noch negativ, so dass sie in der Akutphase-Diagnostik die PCR oder Antigentests nicht ersetzen können. Bei unklaren Konstellationen kann auch die wiederholte Antikörpertestung im zeitlichen Abstand von 7-14 Tagen Klarheit bringen, da neu auftretende SARS-CoV-2-Antikörper oder ein Anstieg des Antikörperspiegels für eine kurz zurückliegende Infektion sprechen.

Wichtiger sind die Antikörpertests allerdings für epidemiologische Untersuchungen. Da ein erheblicher Teil der Infektionen asymptomatisch verläuft und von den symptomatisch verlaufenden Infektionen wiederum nur ein Teil tatsächlich diagnostisch erfasst wird (unterlassene Arztbesuche, Fehldiagnosen, Unterlassen des Labortests, fehlerhafte Probennahme), gibt es eine hohe Dunkelziffer an SARS-CoV-2-Infektionen. Diese führt auch zu einer Fehleinschätzung ihrer Letalität. Überdies ist es für die Einschätzung des künftigen Pandemieverlaufs sowie der erforderlichen antiepidemischen Maßnahmen bedeutsam, wie nahe die Durchseuchung der Bevölkerung bereits in Richtung einer Herdenimmunität fortgeschritten ist. Daher ist es wichtig, durch Reihenuntersuchungen die tatsächliche Rate der jemals mit dem Virus infizierten Personen festzustellen. Wenn solche Zahlen vorliegen, können auch die individuellen Risikofaktoren für eine Infektion besser eingeschätzt werden. Für diese Zwecke sind die Antikörpertests geeignet. Allerdings muss die Interpretation der Ergebnisse solcher Untersuchungen berücksichtigen, dass Antikörpertests keine hundertprozentige Spezifität aufweisen. Vielmehr kommt es durch Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen die im Umlauf befindlichen „harmloseren“ Coronavirus-Typen, die gewöhnliche Erkältungskrankheiten auslösen, zu falsch positiven Ergebnissen. Umgekehrt kann ein Teil der Patienten nach durchgemachter SARS-CoV-2-Infektion eine nur schwache Antikörperbildung aufweisen, die in den Tests nicht erfasst wird. Inwieweit die verschiedenen kommerziellen Tests von diesen Einschränkungen betroffen sind, muss in individuellen Evaluationen festgestellt werden, deren Ergebnisse bei der Interpretation von Reihenuntersuchungen zu berücksichtigen sind, denn die angebotenen Tests unterscheiden sich in den maßgeblichen Parametern erheblich.

Ein besonderes Problem stellt die Feststellung der Immunität dar, denn nur der Nachweis neutralisierender Antikörper ist dafür beweisend. Dafür bedarf es allerdings eines besonders aufwändigen Testverfahrens, des Neutralisationstests. Ob der Nachweis von Antikörpern in den Standardverfahren regelmäßig auch mit dem Vorhandensein von schützenden Antikörpern korreliert, ist noch nicht ausreichend geklärt. Derzeit fehlen auch noch hinlängliche Daten zu der Frage, wie lange nach einer durchgemachten SARS-CoV-2-Infektion ein Immunschutz gegen SARS-CoV-2 tatsächlich besteht, bzw. ob ein vorhandener Immunschutz gegen das ursprünglich infizierende Virus ggfs. durch Virusvarianten unterlaufen werden kann. Wegen des kurzen Zeitintervalls seit Beginn der Pandemie ist auch noch keine Aussage dazu möglich, wie lange Antikörper nach einer Infektion überhaupt nachweisbar bleiben. Dies war auch ein entscheidendes Argument gegen die zeitweise diskutierte Ausgabe von „Immunitätspässen“ (Immunitätsnachweisen) im Zusammenhang mit COVID-19.

Schließlich werden Antikörpertests auch für die Testung von Spendern von Rekonvaleszentenplasma benötigt, sowie für den Nachweis der Immunantwort bei klinischen Studien im Rahmen der Entwicklung von Impfstoffen.

 

Verfahren

P. Scheid, L. Zöller

Antikörpertests

Bei der Mehrzahl der Patienten findet eine Serokonversion in der 2. Woche nach Symptombeginn statt. Aufgrund niedriger Serokonversionsraten in der frühen Phase (Woche 1 bis 2 nach Symptombeginn) der Infektion werden Antikörpertests für die Akutdiagnostik nicht empfohlen. Wie lange wiederum nach SARS-CoV-2-Infektion messbare Antikörpertiter vorliegen, ist derzeit noch unklar. Zum Nachweis einer durchgemachten SARS-CoV-2-Infektion, zur  Ermittlung der SARS-CoV-2-Seroprävalenz sowie zur Abschätzung der Herdenimmunität – stehen für den serologischen Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 ELISA-basierte Verfahren, immunochromatografische Lateral-Flow-Kassettentests und Immunfluoreszenztests zur Verfügung.

Je nach verwendetem Test werden Antikörper der Klassen IgA, IgM und IgG, die gegen Strukturproteine (S1- und/oder S2-Domäne des S-Proteins bzw. gegen das N-Protein) von SARS-CoV-2 gerichtet sind, differenziert. Sie ermöglichen eine qualitative beziehungsweise semiquantitative Aussage bezüglich eventuell vorhandener Antikörper. Mittlerweile werden von zahlreichen Firmen Immunglobulinklassen-spezifische Antikörper-Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 angeboten. In der Regel handelt es sich um Tests, die aus Blut (Vollblut-, Plasma- oder Serumproben) durchgeführt werden. Nicht alle dieser Tests sind CE-(Communauté Européenne)-zertifiziert bzw. gemäß IVD-Richtlinie (Richtlinie über In-vitro-Diagnostika) markiert, einige sind nur für wissenschaftliche Zwecke freigegeben. Die meisten dieser Tests können nur in einer professionellen Laborinfrastruktur durchgeführt werden. Beim Enzymimmuntest (EIA) werden Mikrotiterplatten verwendet, die mit einem Virus-Protein beschichtet sind, z. B. dem Spike-Protein. Patientenproben werden damit inkubiert, und ggfs. in der Probe vorhandene Antikörper können daran binden. Gebundene Antikörper werden dann in einem weiteren Schritt mittels eines Zweitantikörpers detektiert und durch eine enzymatische Reaktion anhand eines erzeugten Farbumschlags sichtbar gemacht, der photometrisch ausgewertet wird. Bei dem ähnlich funktionierenden Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) wird lediglich ein anderes Detektionssystem auf Chemilumineszenz-Basis eingesetzt. Die Auslesung des Chemilumineszenz-Signals bedarf einer speziellen Geräteplattform. Beim Immunfluoreszenztest findet diese Reaktion anstatt in einer Mikrotiterplatte auf einem Objektträger statt, an den virusinfizierte Zellen gebunden sind, und die Detektion erfolgt durch einen Fluoreszenz-markierten Zweitantikörper, dessen Bindung in einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert wird.

Die Sensitivität der Antikörpertests variiert unter anderem in Abhängigkeit vom Zeitpunkt ihres Einsatzes nach Symptombeginn. Die marktverfügbaren Tests unterscheiden sich erheblich im zugrundeliegenden Testaufbau, so dass auch von erheblichen Unterschieden in ihren Leistungsdaten auszugehen ist. Von den Herstellern der Tests werden Sensitivitätswerte bis 100% und Spezifitätswerte bis 99,8% angegeben. Diese Werte dürften sich aber in der Praxis als deutlich zu optimistisch erweisen. ELISA-Testsysteme (z.B. auch zur Quantifizierung der Anti-S1-Domäne des Spike-Proteins von SARS-CoV-2/Rezeptorbindungsdomäne) finden in der Regel in infektionsserologischen Untersuchungslaboratorien Verwendung und weisen eine höhere Sensitivität und Spezifität als die Schnelltests (Kassettentests) auf. Die individuelle Sensitivität und Spezifität der derzeit angebotenen Tests bedarf daher in jedem Fall unabhängiger wissenschaftlicher Evaluationen. Insbesondere ist wichtig, inwieweit sie kreuzreagierende Antikörper gegen die verschiedenen, als Erreger von Erkältungskrankheiten weit verbreiteten Coronavirus-Spezies mit erfassen, d.h. wie spezifisch sie eigentlich für SARS-CoV-2-Antikörper sind.

Zellkultur-basierter Plaque-Reduktions-Neutralisationstest

Während bei den oben beschriebenen Antikörpertests alle Antikörper erfasst werden, die gegen SARS-CoV-2 gerichtet sind, wird zum Nachweis neutralisierender (protektiver) Antikörper gegen SARS-CoV-2 ein sogenannter (Zellkultur-basierter) Neutralisationstest durchgeführt. Dieser biologische Test wird unter Verwendung von Zellkulturen (z. B. permanent wachsende Affennierenzellen; Vero-Zellen) durchgeführt und weist Antikörper nach, die nach Inkubation mit vermehrungsfähigem Virus die Infektion dieser Zellen verhindern können. Mit Hilfe eines solchen Tests kann untersucht werden, ob eine Person neutralisierende Antikörper hat, die eine Infektion durch das Virus verhindern können und damit das Korrelat eines Immunschutzes darstellen. Durch entsprechende Verdünnungsreihen des Serums mit einer definierten Virusmenge von SARS-CoV-2 können die darin enthaltenen neutralisierenden Antikörper auch quantifiziert werden. Zur Durchführung eines Neutralisationstests benötigt man Vollblut, Serum oder Plasma als Ausgangsmaterial. Sofern spezifische neutralisationskompetente Antikörper im Patientenserum vorhanden sind, kommt es zur Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen. Anschließend wird das inkubierte Material auf eine suszeptible Zellkultur inokuliert und gemessen, inwieweit die Infektiosität des Virus durch die vorhandenen Patientenantikörper gehemmt (das Virus neutralisiert) wird. Angegeben wird die höchste Verdünnungsstufe, bei der die Zellkultur noch keine virusbedingten zythopathogenen Effekte (CPE) aufweist. Der Neutralisationstest weist eine hohe Spezifität auf, ist jedoch sehr arbeits- und zeitaufwendig. Neutralisationstests setzen die Tätigkeit mit mit replikationsfähigem SARS-CoV-2 voraus und müssen wegen der damit einhergehenden Virusvermehrung in einem Labor der Schutzstufe 3 (gem. § 5 BioStoffV) durchgeführt werden. Für dieses Testverfahren ist zudem sehr erfahrenes Laborpersonal erforderlich. Daher handelt es sich bei dem Neutralisationstest nicht um ein Routine-Nachweisverfahren für ein breiteres Screening der Bevölkerung. Er kann jedoch eine Relevanz bei der Auswahl von Spendern für Rekonvaleszentenplasma haben.

Zum serologischen Nachweis einer zurückliegenden Infektion mit SARS-CoV-2 stehen sensitive und spezifische Testverfahren zur Verfügung (siehe oben). Serologische Teste, die Antikörper gegen das Spike-Protein von SARS-CoV-2 messen, sind grundsätzlich auch in der Lage Antikörper nach einer Coronavirus-Impfung zu detektieren. Die Spike (S)- und Nukleokapsid (N)-Proteine von SARS-CoV-2 sind hoch immunogen. Über 90 % der  neutralisierenden  Antikörper  bei  COVID-19-Patienten  sind  gegen  die  Rezeptorbindungsdomäne  (RBD) des Spike-Proteins gerichtet. Das Spike-Protein ist das Zielprotein fast aller COVID-19-Impfstoffe. Etwa 90 % der SARS-CoV-2-Infizierten  entwickeln  bis  zum  Tag  10  nach  Symptombeginn  spezifische  Antikörper. Ob eine Schutzwirkung durch Antikörper vorliegt, ließ sich bislang nur mit einem Neutralisationstest zuverlässig untersuchen. Dieser Plaque-Reduktions-Neutralisationstest war jedoch (siehe oben) mit hohen Sicherheitsanforderungen (BSL-3-Labor) und einem hohen und diffizilen manuellen Aufwand verbunden, was eine flächendeckende Verbreitung dieser Tests verhinderte.

Surrogat-Virusneutralisationstest (ELISA)

Seit dem Frühjahr 2021 steht ein kommerzieller, CE-zertifizierter und automatisierbarer Immunoassay für die Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen die S1- Domäne des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 (auch im Hochdurchsatz) zur Verfügung. Neutralisierende  Antikörper  im  Probenmaterial  konkurrieren  dabei im  Inkubationsschritt  mit  dem  Wirtszellrezeptor  (ACE2)  um  die Bindung an S1/ RBD (zu den Mechanismen der Zellinvasion siehe Kapitel Der Erreger: SARS-CoV-2). Der ELISA erlaubt somit die Bestimmung von IgG-Antikörpern gegen SARS-CoV-2 aus Serum, EDTA- und Heparin- Plasma nach einer Coronavirus-Impfung bzw. nach einer durchgemachten Infektion.

Der Test ermöglicht den spezifischen Nachweis von Antikörpern, welche die Bindung von SARS-COV-2-S1/-RBD an ACE2 Rezeptoren inhibieren innerhalb von 2 Stunden. Neutralisierende Antikörper werden mit einer protektiven Immunität gegen eine Zweitinfektion mit SARS-CoV-2 in Verbindung gebracht. Ein solcher Test unterstützt daher die Bewertung der individuellen  Immunantwort  nach  einer  SARS-CoV-2-Infektion  oder  -Impfung  mit  S1-/RBD-basierten Impfstoffen. Ein Sicherheitslabor der Stufe BSL-3 ist nicht notwendig. Die Übereinstimmung der Ergebnisse im Vergleich zum Plaque-Reduktions-Neutralisationstest  wird firmenseitig mit 98,6% beziffert. Die Sensitivität wird mit 95,9%, die Spezifität mit 99,7% angegeben. Mit dem Zellkultur-basierten Neutralisationstest (Plaque-Reduktions-Neutralisationstest) besteht laut Hersteller eine 98,6% Übereinstimmung der Ergebnisse. Den in einigen Ländern anerkannten sogenannten „Genesungszertifikaten“ für die Einreise (Öffnungsverordnungen) wird ein aktueller Nachweis über neutralisierende Antikörper bei der Einreise zu touristischen Zwecken gleichgestellt.